技術摘要

    北蟲草(Cordyceps militaris)是種珍貴藥用菇類，富含多種機能性成份，包括腺苷和蟲草素等。本專利技術主要將北蟲草接種於豆類基質，進行固態培養，所得固態發酵產品以水萃而得萃取物，並利用ICR小鼠模型進行抗疲勞效果評估。

   動物實驗分為控制組(去離子水)、正控制組(長庚生物科技北蟲草菌絲體膠囊)及萃取物實驗組經28天餵食，萃取物分為高(1 g/kg)、中(0.5 g/kg)和低(0.25 g/kg)劑量3組，利用前肢抓力及游泳試驗，並分析小鼠血液中抗疲勞相關生化參數，測試北蟲草豆類萃取物是否具有抗疲勞效果。

    研究結果顯示，在前肢抓力試驗方面，中(122.4 KgF)和高(133.6 KgF)萃取物劑量組顯著優於控制組(89.6 KgF)；另游泳試驗方面，高劑量組(870.2 s)顯著優於控制組(484.0 s)。此外，高劑量組可降低尿素氮、肌酸激酶、乳酸和乳酸去氫酶，另可透過調節肝醣及血糖提供能量來源。綜上可知北蟲草豆類固態發酵培養萃取物高劑量組(1 g/kg)具有抗疲勞效果。

現有技術描述、問題及其缺陷

    傳統抗疲勞藥物常會伴隨副作用，帶給身體額外的負擔，因此，目前許多研究是從自然界中尋求抗疲勞之天然物。北蟲草抗疲勞方面，有研究指出子實體乙醇萃取物可延長小鼠游泳時間、調控疲勞相關生化數值及肝與肌肉肝糖儲存與利用。另亦有研究指出北蟲草子實體水萃物可提升小鼠運動能力，增加ATP和抗氧化酶活性，並降低乳酸和乳酸脫氫酶含量。而本發明之特色是利用北蟲草豆類進行固態發酵，所得固態發酵產品進行水萃而得萃取物，高劑量(1 g/kg) 萃取物具有抗疲勞效果。

科學突破

    利用固態發酵技術製備北蟲草豆類固態發酵產物，此固態培養物與子實體相比，培養時間較短。此固態培養物加水(1:50)經超音波萃取而得萃取物；此萃取物經動物實驗證實具有抗疲勞效果。

產業應用性

    疲勞是現代社會普遍存在且不可忽視的問題，傳統藥物治療常會伴隨副作用；若能從天然物中找尋可抗疲勞之物質，將有助於產品開發之應用。

本技術發明之目的及達成功效

    取北蟲草菌株接種於滅過菌之豆類固態基質上，北蟲草豆類之培養溫度為25°C，相對濕度為80%；經7週培養後，於60°C烘箱乾燥，再以研磨機磨成粉末，利用40 mesh篩網過篩，得到北蟲草豆類固態發酵物。取固態發酵物加去離子水(固液比1:50)，超音波萃取90分，離心(5000 rpm)10 min，收集上清液凍乾而得萃取物。

   利用ICR小鼠模型進行抗疲勞效果評估，分為控制組(去離子水)、正控制組(長庚生物科技北蟲草菌絲體膠囊)及萃取物實驗組經28天餵食，萃取物分為高(1 g/kg)、中(0.5 g/kg)和低(0.25 g/kg)劑量3組，利用前肢抓力及游泳試驗，並分析小鼠血液中抗疲勞相關生化參數，測試北蟲草豆類萃取物是否具有抗疲勞效果。

    研究結果顯示，在前肢抓力試驗方面，中(122.4 KgF)和高(133.6 KgF)萃取物劑量組顯著優於控制組(89.6 KgF)；另游泳試驗方面，高劑量組(870.2 s)顯著優於控制組(484.0 s)。在小鼠血液抗疲勞生化參數方面，中(31.5 mg/dL)和高(31.8 mg/dL) 萃取物劑量組之尿素氮顯著低於控制組(36.8 mg/dL)。在乳酸含量方面，高劑量組(8.24 mg/dL)顯著少於控制組(11.73 mg/dL)，表示高劑量組有助於減少疲勞後乳酸堆積的現象；乳酸去氫酶方面，高劑量組(590.6 U/L)顯著低於控制組(1108.3 U/L)、皆可顯示出其抗疲勞的能力。高劑量組血糖 (171.3 mg/dL)顯著高於控制組(38.0 mg/dL)；另肝臟(2.2152 mg/g tissue)與肌肉(0.5692 mg/g tissue)肝醣含量亦高於控制組(0.8486 mg/g tissue)與(0.1557 mg/g tissue)，表示高劑量組有助於調節對於運動後血糖與肝糖的代謝。綜上所述，北蟲草固態發酵培養萃取物高劑量組(1 g/kg)具有抗疲勞效果。

相關專利資訊

    本發明之特色是利用北蟲草豆類進行固態發酵，所得固態發酵產品進行水萃而得萃取物，並利用ICR小鼠模型進行抗疲勞效果評估。包括前肢抓力和游泳試驗，並針對抗疲勞參數進行分析。

壹、實施方式

一、樣品製備

    取北蟲草菌株接種於滅過菌之豆類固態基質上，北蟲草豆類之培 養溫度為25°C，相對濕度為80%；經7週培養後，於60°C烘箱乾燥，再以研磨機磨成粉末，利用40 mesh篩網過篩，得到北蟲草豆類固態發酵物。取固態發酵物加去離子水(固液比1:50)，超音波萃取90分，離心(5000 rpm)10 min，收集上清液凍乾而得萃取物。

二、實驗動物飼養

    實驗動物為6週齡之雄性ICR小鼠，共40隻，購自樂斯科公司。經體重篩選約32~34 g/隻，分為5組，飼養環境為溫度控制於25℃ ± 2℃、相對濕度60 ± 10%及12小時的光暗循環。經預養4天使其熟悉環境後採自由進食及飲水的方式飼養，每週直接管餵灌食5次，進行28天的試驗，並每週記錄小鼠的體重2次。實驗分組如下 :

控制組(CON) : 餵食去離子水。

正控制組(HS) : 餵食冬蟲夏草菌絲體粉末(Hirsutella sinensis)        0.2 g/kg/day。

低劑量組(LCMB) : 北蟲草黑豆水萃物0.25 g/k g/day

中劑量組(MCMB) : 北蟲草黑豆水萃物0.5 g/k g/day

高劑量組(HCMB) : 北蟲草黑豆水萃物1 g/kg/day

三、運動試驗建立

    飼養至第3周(21天)，進行小鼠前肢抓力試驗，預先練習3次後進行5次的前肢拉力測定，並記錄其數值。飼養至第4周(28天)，進行游泳力竭試驗。於最後一次管餵後禁食12小時。試驗開始時於小鼠尾部綁上體重5%重量的鋁線，將小鼠放入長、寬、深均等的水中，游泳直至沉入水中5秒後立刻撈起並記錄時間，擦乾身上的水休息30分鐘後將其犧牲。

四、檢體處理

    犧牲前，各組小鼠需禁食12小時，游泳力竭休息30分鐘後，麻醉採集心臟血液約1 mL於微量離心管中，靜置1小時待血液分層後以4°C、3000 rpm、20分鐘離心，取上層血清冰入-80°C，以供後續分析乳酸 (Lactate)、血糖 (Glucose)、乳酸脫氫酶 (Lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶 (Creatine kinase, CK)、尿素氮 (Blood urea nitrogen, BUN)。

貳、實驗結果

一、餵食北蟲草黑豆發酵水萃取物對小鼠前肢抓力影響

    餵食北蟲草黑豆發酵水萃取物至第三週時，進行小鼠前肢抓力試驗。由表一可知控制組小鼠前肢抓力為89.6 KgF，低劑量組為103.2 KgF，相較於控制組雖提升1.15倍，但並無顯著差異；另中劑量、高劑量及正控制組前肢抓力1.44倍。中、高劑量組與正控制組三者並無顯著差異，但優於控制組，故餵食北蟲草黑豆水萃取物中和高劑量，可增加小鼠前肢拉力的強度。

二、餵食北蟲草黑豆發酵水萃取物對小鼠游泳力竭試驗之影響

    餵食北蟲草黑豆發酵水萃取物四週後於小鼠尾部加上負重，記錄小鼠游泳直至體力耗盡沉入水中時間。研究結果如圖一所示，控制組游泳時間為475.0秒，低劑量與中劑量組分別為448.0和502.7秒，雖有增加但與控制組相比並無顯著差異；另高劑量組和正控制組則增加至771.0和756.5秒，兩者並無顯著差異，但優於其他各組，顯示餵食高劑量北蟲草黑豆發酵水萃取物可延長小鼠游泳力竭時間，以達到抗疲勞效果。

三、血液中抗疲勞相關生化分析

    餵食北蟲草黑豆發酵水萃取物28天，經游泳力竭試驗後犧牲採集小鼠血液，並分析相關抗疲勞生化參數。

(一) 尿素氮 (Blood urea nitrogen, BUN)

    血液中BUN為生物體中判別腎損傷的指標，當腎受到損害時，會導致BUN釋放至血液中，研究指出高強度運動對血液中BUN釋放會較明顯。由圖二可知，中和高劑量組與控制組相比，小鼠血液中BUN含量有顯著下降；可知餵食中和高劑量的北蟲草黑豆發酵水萃取物可降低運動後血液BUN含量，達到減緩疲勞效果。

(二) 肌酸激酶 (Creatine kinase, CK)

    肌酸激酶存在於骨骼肌的細胞中，當運動過度造成肌肉受損，此時CK會大量釋放至血液中，其含量會隨著休息而逐漸平復，因此血液中CK含量可做為評估餵食北蟲草黑豆發酵水萃取物後肌肉是否受損的指標。小鼠血液中CK活性如圖三所示，低劑量、中低劑量和正控制組分別為995.00、1044.80和824.40 U/L，雖有下降，但與控制組(1158.80 U/L)並無顯著差異；另高劑量組CK活性(404.50 U/L)則顯著降低。由結果可知餵食高劑量北蟲草黑豆發酵水萃取物，可有效減少運動過後血液中CK的活性達到降低肌肉損傷及減緩疲勞作用。

(三)乳酸(Lactate)和乳酸去氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)

    當隨著運動強度與時間的增加，身體需要更多能量，此時有氧呼吸會轉換為無氧呼吸，進行糖解作用轉化葡萄糖為丙酮酸，最後形成乳酸堆積於肌肉。當運動過度會導致乳酸去氫酶無法轉換丙酮酸為乳酸，此時糖解作用會受抑制，身體就會感受到疲勞。乳酸藉由血液往返於肝臟與肌肉中，乳酸去氫酶則普遍存在於許多器官中，因此檢測血液中乳酸及乳酸去氫酶的含量可評估其疲勞程度。

    圖四及圖五為小鼠血液中乳酸與乳酸去氫酶的含量及活性，游泳力竭後生成大量乳酸，控制組、低和中劑量分別為11.73 、11.23和9.99 mg/dL，與彼此間並無顯著差異，高劑量和正控制組分別為8.24和7.79 mg/dL顯著低於控制組，有助於降低運動後乳酸的堆積。在乳酸去氫酶活性方面，控制組為1108.3 U/L；低和中劑量組分別為1191.3和1060.3 U/L，與控制組相比並無顯著差異；高劑量與正控制組則為590.6和753.2 U/L，顯著低於控制組。血液中乳酸去氫酶活性較低，代表從組織中釋放出來亦較少，表示器官並未受損，可減緩疲勞產生。

(四)血糖(Glucose)

    運動過程中，生物體會利用儲存於肝臟中的肝醣轉化為血糖生成ATP，藉以補充持續或長時間運動所需能量。當血液中血糖濃度逐漸下降，來不及提供能量，此時便會產生疲勞感；故藉由檢測運動後小鼠的血糖含量，可評估其疲勞程度。圖六為運動後小鼠血液中血糖含量，由結果可知控制組血糖含量為62.00 mg/dL；低劑量和正控制組分別為60.50和65.80 mg/dL，無顯著差異，而中劑量為86.00 mg/dL與控制組相比雖有提升但又以高劑量組(134.00 mg/dL)之提升最為顯著。

    綜上所述，餵食北蟲草黑豆發酵水萃取物高劑量(1 g/kg/day)，可延長游泳時間與前肢抓力強度，降低尿素氮、肌酸激酶、乳酸和乳酸去氫酶，另可透過調節肝醣及血糖提供能量來源。